【摘要】目的建立人表皮生长因子受体(HER)2的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)检测方法并进行方法学评价。方法以HER2单克隆抗体H7包被，Eu3+标记HER2单克隆抗体E5，建立双抗夹心HER2一TRFIA法，考核该方法的灵敏度、稳定性、特异性、测量范围及正常参考值范围，并与德国Siemens公司的化学发光免疫分析(CLIA)进行相关性分析。结果HER2一TRFIA法的检测灵敏度为0．214rig／ml；测量范围为0．214～1000ng／ml：批内和批间cy的均值分别为3．48％和4．13％：与HERl无交叉反应，正常参考值范围为0—13．20ng／ml；与CLIA的相关性良好(r=o．997)：同一批试剂4℃下可稳定放置6个月以上。结论HER2一TRFIA法是一种灵敏度高、特异性好、精密度佳的检测方法，能满足临床使用的需要。

【关键词】受体,表皮生长因子:乳腺肿瘤,荧光免疫测定

人表皮生长因子受体(humanepidermalgrowthfactorreceptor，HER)2是一种I型受体酪氨酸激酶，在细胞生长、发育及分化过程中起着重要的作用，HER2的过表达与肿瘤的发生与转移密切相关¨J。近年来，HER2靶向治疗是肿瘤治疗领域的研究热点．针对HER2的检测在HER2阳性乳腺癌治疗方案的选择、预后评估及疗效预测中起着关键作用[2]。《乳腺癌HER7．检测指南(2014版)》口]再次强调了乳腺癌HER2检测的重要性。本研究采用2株抗人HER2单克隆抗体(简称单抗)分别作为固相抗体和Eu3+标抗体，建立血清HEIL2抗原的时间分辨荧光免疫分析(time．resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)检测方法(即HRE2．TRFIA法)，并进行了方法学评价。

材料与方法

1．试剂与仪器。HER2单抗H7和E5为北京WasonBiotech公司产品，重组人HER2标准品为美国OrigeneTechnologies公司产品：化学发光免疫分析(chemiluminescentimmunoassay，CLIA)检测试剂盒为德国Siemens公司产品；Eu3+标记盒为美国PerkinElmer公司产品；二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepenlaaceticacid．DTPA)为美国Sigma公司产品：96孔微板为美国Coming公司产品；增强液、洗涤液及封闭液均由无锡市江原实业技贸总公司提供：其他试剂为国产分析纯。PD一10柱和SepharoseCL一6B柱为瑞典Pharmacia公司产品。全自动时间分辨Auto—DELFIA1235检测仪购自于美国PerkinElmer公司。

2．血清样本。30例HER2阳性血清来自于江苏省江原医院、江阴市人民医院、吉林大学中日联谊医院经病理确诊的乳腺癌患者，经CLIA法测定均为HER2阳性。84名健康体格检查者血清来自江苏省江原医院。所有血样均用真空管采集，室温下静置30min．分离后的血清置于一20℃冰箱待检。

3．固相抗体的包被。取H7单抗用50mmol／L碳酸钠缓冲液(pH值9．6)稀释至5斗g／ml，作为包被液。按每孔加200Ixl加至96孔微孔板，4℃包被过夜。弃包被液，洗涤液冲洗3次，每；fL力l250斗l含3g／L牛血清白蛋白(bovinesel"umalbumin，BSA)的上述缓冲液封闭，室温放置2h。弃封闭液，真空抽干并密封后放置一20℃保存待用。

4．Eu3+标抗体的制备。先经PD．10柱，将E5单抗的缓冲体系转换为50mmoL／L碳酸钠缓冲液(pH值8．5，含155mmol／LNaCl)；然后，将新缓冲体系中的E5单抗浓缩至2g／L。取500IxgE5单抗，加至300I乩mol的Eu3+一二乙烯三胺四乙酸(di—ethyleBetriaminetetraacetate，DTFA)中．以保证E5单抗与DT?A．Eu3+充分连接，25cC磁力搅拌反应18h。反应获得的Eu3+．E5经SepharoseCL．6B柱(1cmX40em)纯化后，进行稀释、分装、冻干，并于一20℃保存待用。

5．HRE2．TRFIA法。将3旧Eu3+．E5用150山反应缓冲液『50mmol／L三羟甲基氨基甲烷(tri．hydroxy．methylaminomethane，％s)．HCl，8mmol／LNaCl，质量分数0．1％BSA，50p,mo]／LDTPA，0．1ml／LTween．80，质量分数0．1％NaN，，pH值7．8]稀释成工作液，将HER2标准品(0、5、10、50、100、500、1000ng／m1)或待测样本血清各50斗l加至96孔板，再加入150¨l工作液，25℃下温育2h，洗涤6次，再加200斗l增强液于25。C振荡反应5min，将96孑L板置于全自动AutoDELFIA1235检测仪上，按照实验室自行编制的程序自动检测荧光信号，生成双对数函数标准曲线．并自动给出待测样品中的HER2含量。

6．参比检测方法的试剂及仪器。CLIA检测严格按德国Siemens公司试剂盒说明书进行标准化操作．仪器操作严格按照仪器操作规程进行。

7．HRE2．TRFIA法的方法学评价[3。5]。(1)最低检浸0限：分3次每次测定10孔标准品零质量浓度点的荧光值，求出x+2s值，在标准曲线上得出该值对应的浓度值即为HER2一TRFIA法的灵敏度。(2)相关性：以简单随机抽样法抽取34名健康体格检查者血清和30例HER2阳性乳腺癌患者血清，分别用TRFIA法及CLIA法进行检测，比较2种方法的相关性。(3)精密度：将浓度最大的样本稀释成高、中、低3个质量浓度，用TRFIA法检测，并分析批内和批间精密度。(4)回收率：在3份不同浓度的血清样品分别添加一定浓度的标准品，用TRFIA法检测并计算回收率。(5)特异性：将已知低质量浓度的HER2血清分为试验组和对照组，前者加入500ng／ml的HERl．后者不添加HERl，分别检测2组血清中的HER2含量。

8．正常参考值范围。对84名健康体格检查者血清进行HER2检测，以x+2s为正常参考值范围。

9．统计学处理。采用IBMSPSS19．0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以露±s表示，并采用两样本t检验进行组间比较：对TRFIA及CLIA法进行Pearson相关分析。P<0．05为差异有统计学意义。

结果

1．Eu3+．E5的理化鉴定。Eu3+一E5经SepharoseCL一6B柱层析，第1洗脱峰的E5蛋白质的物质的量为7．2nmol，Eu3+的物质的量为48．35nmol，即平均每个E5抗体分子上连有6．7个Eu3+。

2．HRE2．TRFIA法的标准曲线、灵敏度及测量范围。HER2．TRFIA的标准曲线如图1所示。该方法检测HER2的灵敏度为0．214ng／n[1l，测量范围为0．214～1000n∥ml

3．HRE2．TRFIA法的特异性、精密度、回收率和稳定性。加有HERl标准品的试验组值与对照组值差异无统计学意义(t=0．042，P>0．05)，表明该方法特异性良好。

4．HER2一TRFIA法检测高、中、低3个质量浓度HER2样品的批内CV分别为2．74％、2．91％和4．80％，批间CV分别为3．26％、4．21％和4．92％，均低于10％，表明TRFIA法检测HER2精密度良好。3份不同质量浓度的血清样品添加标准品后所测得的回收率见表1。同一批试剂4℃放置6个月后，参考标准发光计数无明显变化(t=0．930，P>0．05)，说明该方法稳定性良好。

5．HRE2．TRFIA法与CLIA法的相关性。分别用HRE2一TRFIA法及CLIA对血清样本进行检测，如图2所示，两者相关性良好(r=0．997，P<O．01)。其中CLIA检出的阳性血清样品经TRFIA法检测均为阳性。

6．HRE2．TRFIA法的参考值范围。HRE2一TRFIA法检测84名健康体体检者血清HER2的结果为(5．88±3．66)ng／n!ll。若以面±2s作为正常参考值范围，则健康人血清HER2的正常参考值范围为在0～13．20ng／ml。

讨论

HER2是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白，是表皮生长因子受体家族成员之一。HER2与其他家族成员(如HERl、HER3、HER4等)形成广泛的信号网络，能增强肿瘤细胞的增殖、抑制肿瘤细胞的凋亡、促进肿瘤细胞的迁移[2]。研究…表明HER2的高表达通常与上皮细胞癌症的恶化程度密切相关。是肿瘤治疗的关键预后指标。已有文献[6]报道HER2在乳腺癌、卵巢癌、胃肠道癌、肺癌等多种肿瘤中表达量增加。HER2已作为乳腺癌诊断和治疗的靶点应用于临床，乳腺癌患者血清和组织的HER2水平升高已经被证实o7|。

目前，HER2临床检测方法主要有免疫组织化学检查和基因检测【2'8‘9]。虽然两者都可较准确地检测HER2表达，但都需要手术获取组织标本，具有侵入性。也不适合前期疾病预查及预后评估。细胞表面HER2可经蛋白酶水解而脱落释放到血清中。研究[10]表明，血清HER2对乳腺癌的早期检出率为6．0％。12．3％．对晚期乳腺癌的检出率高达23．0％一80．0％。

现有的HER2血液检测方法主要有酶联免疫吸附测定(enzyme—linkedimmunosorbentassay，ELISA)法和CLIA法[III。ELISA检测法灵敏度较低．检测范围窄，采用非自动化操作易造成检测误差：CLIA检测试剂及检测仪器均为进El产品，单次检测成本高。本研究所采用的TRFIA检测法在抗原抗体反应的基础上引入稀土元素(Eu3+)标记，是目前较为先进的超灵敏检测手段[12|。采用Eu3+标记抗体，无损抗体的免疫活性．多位点标记又增强了检测灵敏度，测定时增强液的使用使荧光强度以百万倍增加．因而可实现样本中待检物质的极微量检测[13。15]。

本研究中TRFIA法定量检测HER2的最低检测限为O．214ng／ml，测量范围较宽。在本试验中向已知低质量浓度血清样本中加人高质量浓度HERl．TRFIA法检测结果与不加入HERl的血清样检测结果差异无统计学意义，说明该方法的特异性良好。此外，该方法的批内及批间CV均小于10％，检i贝0结果重复性好。回收率为96．52％～104．78％，检测的准确性高；不论是低质量浓度还是高质量浓度血清样品，该方法的检测结果与CLIA均有良好的相关性(r=0．997)。

综上。本研究成功建立了血清HER2的TRFIA检测方法。为临床HER2高表达肿瘤患者的筛查和预后评估创造了条件。