【摘要】观察肝素对脂多糖（LPS）刺激肾脏微血管内皮细胞（RMVECs）形态学改变及一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）表达的影响。方法采用三步梯度筛网法原代培养大鼠RMVECs，取长势优异的3～4代细胞进行实验，并分为空白对照组、10mg/LLPS处理组和2.5、5、10kU/L肝素预处理组（LPS刺激前0.5h给予相应剂量肝素干预）。透射电镜下观察LPS刺激24h细胞形态学改变；于LPS刺激5、15、30、45min采用免疫荧光法检测RMVECs内ROS表达；采用硝酸还原酶法检测RMVECs内NO生成情况。结果①空白对照组RMVECs细胞膜完整，细胞内线粒体和内质网清晰可见，核膜完整，核仁明显。LPS刺激24h后，RMVECs细胞器空泡变性明显，以线粒体为主，且细胞膜产生大量微粒体。经10kU/L肝素预处理后，细胞器空泡变性明显减轻，细胞膜形态稳定。②LPS刺激5min即可在RMVECs细胞内检测到ROS表达和NO生成明显增加，并随时间延长逐渐增加，ROS表达30min达峰值，NO生成45min达峰值，与空白对照组同期比较差异均有统计学意义〔30minROS（平均荧光值）：76.2±5.8比1.5±0.1，45minNO（μmol/L）：70.3±8.6比1.8±0.1，均P＜0.01〕。随肝素剂量增加，预处理RMVECs后细胞内ROS表达及NO生成逐渐减少，以10kU/L作用最明显，与LPS处理组同期比较差异均有统计学意义〔30minROS（平均荧光值）：16.8±1.7比76.2±5.8，45minNO（μmol/L）：11.8±8.6比70.3±8.6，均P＜0.01〕。结论肝素可通过下调LPS诱导的NO、ROS表达和稳定细胞形态发挥保护肾脏内皮细胞的作用，以10kU/L作用最明显。

【关键词】肝素,脂多糖,肾脏微血管内皮细胞,活性氧,一氧化氮

脓毒症致急性肾损伤（AKI）具有高发病率和高病死率的特点，接近半数的脓毒症患者在血培养阳性时发现AKI，是脓毒症患者危及生命的重要影响因素，故探究AKI在脓毒症时的发生发展过程和机制对改善预后有益［1］。内皮细胞是脓毒症时炎症反应作用的靶部位，同时也是效应部位，其损伤后释放大量活性物质，启动炎症和凝血反应的交联对话，是脓毒症发生器官功能损伤的病理生理机制之一。

在脓毒症发生过程中，体内以病原分子模型和损伤分子模型两种方式释放大量炎性介质，激活中性粒细胞，中性粒细胞活化后产生一系列可损伤内皮细胞的活性因子，包括活性氧（ROS）、超氧阴离子、补体活性片段和蛋白水解酶等，均可使内皮细胞的线粒体发生氧化应激损伤，产生大量氧自由基，包括超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基、二氧化氮、一氧化氮自由基、过氧化氢、单线态氧和臭氧等。ROS可使细胞内多种分子发生结构改变，从而失去正常功能和活性，最终导致代谢失调和细胞损伤［2］。在脓毒症和感染性休克时，ROS可直接导致细胞凋亡和坏死，直接参与DNA功能受损［3］。肝素作为传统抗凝药物广泛应用于临床，近年来针对肝素在脓毒症中的非抗凝作用研究方兴未艾，本研究拟探讨肝素对肾脏微血管内皮发挥保护作用的机制是否与下调ROS和一氧化氮（NO）表达相关。

1材料与方法

1.1 实验动物：SPF级雄性Wistar大鼠，3～8日龄，体重15～20g，购自中国医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（辽）2015-0001。

1.2 原代培养肾脏微血管内皮细胞（RMVECs）：采用脊髓离断法处死大鼠，置入75%乙醇中，开腹取出双肾，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，剥离肾被膜，取外层1/3肾皮质，剪碎后尼龙筛网（80、100、200目）过滤，室温离心弃上清，加0.125%胰蛋白酶，10min后室温离心弃上清。重复上述过程，以PBS作为洗液充分去除胰蛋白酶后，倒入含20%胎牛血清的DMEM培养基，置于培养箱（37℃、5%CO2）中孵育，待细胞铺满培养瓶底部80%以上时用0.125%胰蛋白酶〔含0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）〕传代，取长势优异的第3～4代细胞进行后续实验。

1.3 分组和处理：将无血清培养基加入待实验细胞后24h进行分组处理。LPS处理组：加入10mg/LLPS（美国Sigma公司）处理5、15、30、45min；2.5、5、10kU/L肝素预处理组：于LPS刺激前0.5h分别给予相应剂量肝素钠（沈阳第一生化制药）干预；空白对照组不予任何处理。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 细胞形态学观察：将各组细胞处理24h后,用戊二醛固定，铀-铅染色，透射电镜下观察。

1.4.2 RMVECs内ROS表达检测：应用无血清培养基稀释2＇，7＇-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA），工作液浓度10μmol/L，取2mL加至细胞培养瓶中，于培养箱孵育20min后弃上清，用无血清培养基清洗，重复3次后检测ROS表达。DCFH-DA自带荧光，可作为探针标记ROS，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，计算平均荧光值，间接反映ROS的表达。

1.4.3 RMVECs内NO含量检测：收集各组细胞上清液，置于小离心管（EP管）中超低温冰箱保存待测。根据NO检测试剂盒（南京建成生物科技有限公司）说明书，采用硝酸还原酶法测定NO含量。在波长540nm处检测吸光度（A）值，计算NO含量〔NO（μmol/L）＝（测定管A值－空白管A值）/（标准管A值－空白管A值）×标准品浓度（100μmol/L）×样品测试前稀释倍数〕。1.5统计学分析：应用Graphpad5.0软件作图，应用SPSS13.0软件分析数据。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），两组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1RMVECs细胞形态学改变（图1）：微血管内皮细胞胞质内血管性血友病因子（vWF）呈阳性表达即证明培养的细胞为内皮细胞［4］。空白对照组细胞形态无明显异常。采用10mg/L的LPS处理24h后，RMVECs细胞膜失去完整性，表现为细胞膜微粒体大量形成；细胞内细胞器出现明显的空泡变性，以线粒体、内质网更为显著；细胞核形态完整，核膜皱褶增加，形态变小。经10kU/L肝素预处理后，RMVECs细胞膜较完整，细胞器无明显空泡形成，核膜形态无明显变化。

2.2RMVECs内ROS表达（图2～3）：采用10mg/L的LPS处理5min即可在RMVECs细胞内观察到明显的ROS表达，并随时间延长逐渐增加，30min达峰值，随后下降，但45min时仍维持在较高水平。经2.5、5、10kU/L肝素预处理后，RMVECs内ROS表达较LPS处理组同期明显降低，并呈一定剂量依赖性，以10kU/L肝素作用最明显（均P＜0.05）。

2.3RMVECs内NO生成（图4）：空白对照组几乎无NO表达。采用10mg/L的LPS处理RMVECs5minNO含量即较空白对照组明显增加，并呈时间依赖性（均P＜0.05）。经2.5、5、10kU/L肝素预处理后，各时间点RMVECs内NO含量均明显降低，以10kU/L的作用最明显（均P＜0.05）。

3讨论

内皮细胞与中性粒细胞的相互作用是脓毒症致AKI的发病机制之一。脓毒症时过度释放的炎性介质激活中性粒细胞，产生超氧阴离子、ROS、蛋白水解酶和补体活性片段等，导致内皮细胞损伤。同时，过度的炎症反应状态可抑制中性粒细胞凋亡，凋亡延迟使其持续黏附于血管内皮细胞，造成血管内皮细胞间隙增大，内皮的屏障功能破坏和通透性增加，从而加重器官功能损伤。中性粒细胞“呼吸爆发”产生大量ROS，辅助吞噬细胞杀灭病原体。新近研究显示，ROS具有非传统的细胞信号转导功能［5-6］。表明ROS在细胞损伤和器官功能不全的发生发展过程中起到了双重作用：一方面，可直接作为损伤分子；另一方面，可作为信号转导因子调节细胞代谢和死亡。从探索治疗手段的角度来讲，减少ROS过度释放，可能成为阻断疾病进程的靶点。

研究表明，脓毒症时NO表达显著升高，与器官功能不全相关［7-8］。阻断一氧化氮合酶（NOS）信号转导能减轻脓毒症致AKI［9］。谷胱甘肽可避免NO和ROS大量生成所致器官功能损伤，说明NO、ROS释放在脓毒症中是与预后直接相关的重要因子［8］。

肝素的非抗凝作用在脓毒症治疗中前景广阔。在临床研究方面虽无大规模随机对照研究结果作为强有力的证据被指南推荐，但高水平荟萃分析提示，肝素对脓毒症预后有改善作用［10］。脓毒症的特点是炎性介质大量释放，失控和宿主免疫系统对这种攻击的强烈抵御，涉及中性粒细胞“呼吸爆发”、向损伤部位趋化及单核/巨噬细胞系统激活。动物实验结果提示：肝素可下调白细胞介素（IL-1β、IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达［11-12］，减少趋化因子释放，保护内皮细胞［13］；可通过抑制NOS表达缓解器官功能损伤程度［14］。本课题组研究提示，肝素可抑制炎症反应［15-16］，保持内皮正常屏障功能［17］，降低内皮通透性［18］，降低脓毒症动物死亡率［19］。

本研究显示，原代培养RMVECs在LPS刺激下发生形态学改变，细胞功能受损，短时间内ROS明显增加，NO大量生成，与前期研究结果一致［4，14］。细胞内生成的ROS和NO分子极不稳定，作为损伤因子的同时亦可发挥第二信使的信号转导功能，继发级联放大的连锁反应。本研究显示，以LPS刺激5min为起始时间点，可观察到细胞内有ROS产生，并随时间延长呈增加趋势，30min达峰值后下降，但45min时仍处于高水平。刘秀娟等［20］用LPS处理24h后还能在脓毒症大鼠模型中检测到NO表达处于（188.30±5.18）μmol/L的较高水平，明显高于本研究结果，可能与研究对象不同有关。本实验旨在观察ROS与NO的关系，故未延长观察时间点。

综上，肝素可减轻LPS诱导的肾脏微血管内皮损伤，主要表现为减少细胞器空泡变性及下调ROS和NO的表达，在脓毒症致肾损伤治疗方面有了新的尝试，但肝素的作用机制尚需进一步探讨和研究。